شمارش باکتری‌ها

روش‌های شمارش باکتری‌ها

پژهشگران عزیز در بسیاری از آزمایش‌های میکروبی باید بتوانیم تعداد باکتری‌ها را بشماریم. این شمارش می‌تواند در یک‌سان‌سازی دوز مصرفی باکتری یا مقایسه و سنجش اثر یک ماده بر شمار باکتری‌ها به کار برده شود. روش‌های گوناگونی برای شمارش باکتری‌ها به کار می‌رود که به هدف شمارش، امکانات موجود و مایع یا جامد بودن کشت باکتری بستگی دارد.

 

روش تهیه‌ی رقت:

ابتدایی‌ترین روش شمارش باکتری‌ها کشت دادن حجم خاصی از سوسپانسیون آن‌ها روی محیط کشت می‌باشد. در این روش حجم خاصی از سوسپانسیون باکتری روی محیط کشت جامد کشت داده می‌شود و پس از سپری‌شدن زمان لازم برای رشد باکتری، تعداد کلنی‌ها شمارش می‌شود (اگر این حجم خیلی کم باشد دقت کار پایین می‌آید). هر کلنی به توده‌ای از باکتری‌ها گفته می‌شود که در نتیجه‌ی رشد یک عدد باکتری اولیه روی محیط جامد ایجاد شده است.

شمارش باکتری‌ها

در شکل بالا کلنی‌های سفید و قرمز از دو سویه‌ی مخلتف باکتری اشریشیا کلی را می‌بینید.

 

بنابراین پس از رشد، می‌توان تعداد کلنی‌ها را برابر با تعداد باکتری‌ها در سوسپانسیون اولیه در نظر گرفت. ایراد این روش، فراگیر نبودن آن می‌باشد. زیرا در صورتی که تعداد باکتری‌ها خیلی زیاد باشد، آن‌ها تمام سطح پلیت را می‌پوشانند و تفکیک و شمارش تعداد کلنی‌ها ممکن نیست. از طرفی برخی میکروب‌ها ممکن است روی محیط جامد قابل کشت نباشند. اما با این حال هنوز این روش در بسیاری موارد کاربردی و مفید است. برای رفع اشکال فراوانی بیش از حد شمار باکتری‌ها (و در نتیجه به هم چسبیدن کلنی‌ها) از روش تهیه‌ی سریال رقت به ترتیب زیر استفاده می‌شود.

1- 10 عدد لوله‌ی آزمایش دربسته حاوی 9 میلی‌لیتر آب مقطر یا سرم فیزیولوژی یا محیط کشت (بسته به نیاز) را استریل کنید. لوله‌ها را از 1 تا 10 شماره‌گذاری کنید و به ترتیب درون جا لوله‌ای قرار دهید.

2- از نمونه‌ی اولیه که می‌خواهید باکتری‌های آن را بشمارید یک میلی‌لیتر در شرایط استریل (کنار شعله یا زیر هود) به لوله‌ی شماره‌ی 1 منتقل کنید.

3- محتوای لوله‌ی اول را خوب مخلوط کنید تا رقت 1-10 شما کاملاً یک نواخت گردد. سپس از 1 میلی‌لیتر از آن را در شرایط استریل به لوله‌ی بعدی منتقل کنید.

4- مرحله‌ی قبل را به ترتیب برای لوله‌های بعدی تکرار کنید تا رقت 10-10 به دست آید. در شکل زیر همین روند را مشاهده می‌کنید. هر چه رنگ کم‌رنگ‌تر می‌شود نشان‌دهنده‌ی رقیق‌تر شدن سوسپانسیون اولیه است.

شمارش باکتری‌ها

5- حال می‌توانید از تمام رقت‌ها هر کدام حجم معینی (مثلاً 1 میلی‌لیتر) را به یک پلیت محیط‌کشت جامد منتقل کنید و پس از سپری‌شدن زمان رشد، تعداد کلنی‌ها را بشمارید و بر رقت تقسیم کنید تا تعداد باکتری در حجم اولیه به دست آید.

300عدد کلنی 1 میلی‌لیتر از رقت 5-10

مجهول 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون اولیه یا رقت 100

شمارش باکتری‌ها

6- از آن جا که به دلیل وجود خطا در انجام آزمایش ممکن است تعداد باکتری اولیه‌ی به دست آمده از هر رقت با دیگران برابر نباشد، داده‌های پرت را کنار بگذارید و از بقیه میانگین بگیرید.

مثال:

شمارش باکتری‌ها

یکی از مهم‌ترین کاربردهای این روش در تعیین MIC‌ یا کم‌ترین غلظت مهارکننده‌ی رشد باکتری است که برای تعیین توانایی مهارکنندگی مواد ضدباکتری مانند آنتی‌بیوتیک‌هاست.

 

اسپکتروفتومتری یا سنجش عبور نور:

برای کار با این دستگاه باید باکتری در محیط کشت مایع باشد. این دستگاه شامل یک منبع نوری، یک شبکه‌ی پراش برای پخش کردن نور به طول‌موج‌های تشکیل‌دهنده، ویال‌های شفاف (از جنس پلاستیک، شیشه و کوارتز بسته به نوع مصرف) با توانایی عبور نور نزدیک به صددرصد و یک آشکارکننده‌ی شدت نور عبوری می‌باشد.

شمارش باکتری‌ها

در شکل شماتیک بالا اجزای یک استپکتروفتومتر را مشاهده می‌کنید.

 

برای سنجش مقدار سلول‌ها:

مقدار مورد نیاز (معمولاً 1 تا 4 میلی‌لیتر) از سوسپانسیون باکتری‌‌ها در محیط کشت یا آب مقطر را در یک ویال شیشه‌ای می‌ریزیم. از مایع مورد استفاده در تهیه‌ی سوسپانسیون در ویال دیگری می‌ریزیم تا به عنوان شاهد استفاده شود. زیرا ممکن است درصدی از نور توسط ماده‌ی زمینه‌ای جذب شود.

هر ماده‌ای طول‌موج ویژه‌ای را جذب می‌کند. بنابراین باید طول‌موج مخصوص به خودش را روی دستگاه تنظیم کرد.

دستگاه با توجه به درصد نور عبوری و فرمول‌های محاسباتی که پیش‌تر در آن ذخیره شده است، عددی به ما می‌دهد که می‌توان با نمودارهای استاندارد مقایسه کرد و تعداد باکتری‌های موجود در واحد حجم را به دست آورد.